Yöntemin temeli DNA replikasyonuna ve modifiye dideoksinükleotidlerin (ddNTP) bağlanması durumunda, yeni sentezlenen zincirin uzamasının durmasına dayanmaktadır. ddNTPler (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) fluoresan işaretlidir ve DNA’da bulunan serbest 3’-OH gurubuna bağlanıp sentezi durdurur. DNA parçacık boylarındaki farklılıklar otomatize dizi analizi sistemlerinde tespit edilir.